一、RNA模板的制备

RNA模板的制备常用的提取方法包括传统的酚/氯仿抽提法和柱式抽提法。以下是这两种方法的操作流程概要。

酚/氯仿抽提法

以尊龙凯时的RNA抽提试剂（如Vazyme RNAisolater Total RNA Extraction Reagent，编号：Vazyme#R401）为例，所需材料包括氯仿、异丙醇、75%乙醇（用DEPC水配制）及DEPC水。

样本制备：过多的样本量可能导致样本裂解不充分并降低产物纯度。1ml RNAisolater能够充分裂解的最大样本量如下：

• 贴壁细胞：对于贴壁牢固的细胞可用细胞刮勺剥离。1. 废弃培养液，PBS洗涤一次。2. 每10cm²培养面积的细胞加入1-3ml RNAisolater，使其充分覆盖细胞表面，然后用移液器吹打细胞直至分散。3. 将裂解液转移至15ml离心管中，用移液器反复吹打至无明显颗粒，冰上静置5分钟。
• 悬浮细胞：1. 离心收集细胞，PBS洗涤一次。2. 每5×10⁶-10⁷个细胞加入1ml RNAisolater，3. 用移液器吹打至无明显颗粒，冰上静置5分钟。
• 动物组织：液氮研磨：1. 将研磨的粉末转移至离心管中，加入RNAisolater裂解液，待样品溶解后，轻轻吹打直至透明。2. 将裂解液转移至离心管中以12,000×g在4℃下离心5分钟，吸取上清液。
• 匀浆处理：1. 将新鲜组织剪碎并浸泡在RNAisolater裂解液中，用电动匀浆器高速匀浆。2. 将裂解液转移至离心管中，以12,000×g在4℃下离心5分钟，吸取上清液。

柱式抽提法

以尊龙凯时的FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation MiniKit（编号：Vazyme#RC101/RC111）为例，自备材料有β-巯基乙醇、无水乙醇和RNase-free枪头等。

培养细胞操作如下：

• 贴壁细胞：无需消化，直接使用Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇）进行裂解。或使用胰酶消化后离心收集细胞，加入Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇），每2-5×10⁶个细胞加入500μl Buffer RL1，轻轻吹打混匀直至无细胞团块。（使用前在Buffer RL1中加入β-巯基乙醇至1%浓度以备使用）。
• 悬浮细胞：离心收集细胞，加入Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇），每2-5×10⁶个细胞加入500μl Buffer RL1，轻轻混匀直至无细胞团块。如果不立即进行下一步操作，可将其置于-70℃保存。

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